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DNA聚合酶的相關(guān)知識(shí)解讀

發(fā)布日期： 2019-09-26
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 　　DNA聚合酶是細(xì)胞復(fù)制DNA的重要作用酶。隨著分子克隆技術(shù)，測(cè)序技術(shù)，基因診斷技術(shù)的發(fā)展，DNA聚合酶在生物技術(shù)中的作用也越來(lái)越多，各種通過基因手段突變的DNA聚合酶廣泛的應(yīng)用在生物技術(shù)中。DNA聚合酶的主要活性是催化DNA的合成（在具備模板、 引物、dNTP 等的情況下）及其相輔的活性。
DNApolⅠ的DNA聚合酶活性和外切酶活性協(xié)同作用，可以使DNA鏈上的切口向前推進(jìn)，即沒有新的DNA合成，只有核苷酸的交換。這種反應(yīng)叫缺口平移(Nick translation)。當(dāng)雙鏈DNA上某個(gè)磷酸二酯鍵斷裂產(chǎn)生切口時(shí)，DNApoIⅠ能從切口開始合成新的DNA鏈，同時(shí)切除原來(lái)的舊鏈。這樣，從切口開始合成了一條與被取代的舊鏈*相同的新鏈。如果新?lián)饺氲拿撗鹾塑账崛姿釣?alpha;-32P-dNTP，則重新合成的新鏈即為帶有同位素標(biāo)記的DNA分子，可以用作探針進(jìn)行分子雜交實(shí)驗(yàn)。
酶的專一性主要表現(xiàn)為新進(jìn)入的脫氧核苷酸必須與模板DNA配對(duì)時(shí)才有催化作用。dNTP進(jìn)入結(jié)合位點(diǎn)后，可能使酶的構(gòu)象發(fā)生變化，促進(jìn)3-OH與5-PO4結(jié)合生成磷酸二酯鍵。若是錯(cuò)誤的核苷酸進(jìn)入結(jié)合位點(diǎn)，則不能與模板配對(duì)，無(wú)法改變酶的構(gòu)象而被339;-539;外切酶活性位點(diǎn)所識(shí)別并切除之。
TaqDNA聚合酶還要具有非模板依賴性活性，可將PCR雙鏈產(chǎn)物的每一條鏈3-39;加入單核苷酸尾，故可使PCR產(chǎn)物具有3-39;突出的單A核苷酸尾;另一方面，在僅有dTTP存在時(shí)，它可將平端的質(zhì)粒的3-39;端加入單T核苷酸尾，產(chǎn)生3-39;端突出的單T核苷酸尾。應(yīng)用這一特性，可實(shí)現(xiàn)PCR產(chǎn)物的T-A克隆法。